01. oktober 2002

Bakterier i seks dimensioner

Cellebiologi

Nej, det er ikke titlen på en ny science fiction film. Det er derimod den daglige virkelighed for levnedsmiddelkandidat Henrik Siegumfeldt, som forsker i cellebiologi ved Mejeri- og Levnedsmiddelinstituttet på Det Biovidenskabelige Fakultet for Fødevarer, Veterinærmedicin og Naturressourcer. Ved hjælp af et meget avanceret mikroskop kan han lave detaljerede analyser af enkeltcellers fysiologi.

Henrik Siegumfeldt studerer enkeltceller af bakterier eller gærsvampe, som bruges i produktionen af levnedsmidler. Organismer, som han samler under ét med ordene positiv mikrobiologi.

I Danmark er der tre store områder indenfor fødevareproduktion, hvor man bruger mikroorganismer positivt; det drejer sig om alkoholfermentering (øl, vin, spiritus), mælkefermentering (yoghurt, ost m.m.) og brødproduktion.

I den traditionelle mikrobiologiske forskning studerer man populationer af bakterier eller svampe. Man laver for eksempel en pladespredning (dyrkning på agar i en petriskål), hvorefter man isolerer en enkelt koloni af celler og dyrker dem i kulturer.

Man antager derefter, at alle cellerne i kulturen opfører sig ens, idet de stammer fra én celle.

Hvis man bevæger sig væk fra deciderede laboratorieforsøg, med kolber og reagensglas, og vil studere mikrobiologien i selve levnedsmidlerne er sagen en helt anden.

Så er der pludselig en hel masse faktorer, som påvirker de enkelte celler, og det giver ikke længere mening at studere en "gennemsnitlig celle".

Og det er baggrunden for Henrik Siegumfeldts mikroskop.

De seks dimensioner

Mikroskopet er et såkaldt omvendt mikroskop, hvor objektivet sidder under præparatet, og hvor man dermed kigger op i bunden af præparatet.

Det er en fordel, fordi man kan have cellerne "liggende" i en væske, mens man på et traditionelt mikroskop har "klemt" cellerne fast imellem to glas.

Mikroskopet er motoriseret og styres ved hjælp af en computer og et joy stick.

Og så har man altså mulighed for at studere sit præparat i seks dimensioner:

De tre første dimensioner findes på alle mikroskoper; der er en x- og y-retning i det horisontale plan samt en z-retning, så man kan fokusere op og ned i præparatet i det vertikale plan.

Derudover er mikroskopet koblet til en monokromator, som giver mulighed for at studere præparatet ved forskellige bølgelængder.

Man kan altså farve cellerne i præparatet med forskellige fluorescerende farvestoffer og belyse det ved forskellige bølgelængder; det kan for eksempel være farvestoffer som afspejler DNA-mængden, intracellulær pH (pHi), membranpotentialet osv. Det er den fjerde dimension.

Den femte dimension er tidsfaktoren. Man kan indstille mikroskopet til at udføre automatiske målinger i et defineret tidsinterval. På den måde kan man for eksempel følge udviklingen i en cellekultur, og måske få klarlagt hvad der får celler til at dele sig.

Med den sjette, og sidste, dimension kan man gemme præcise koordinater fra bestemte steder i præparatet. Man kan dermed gå tilbage og kigge på nøjagtig det samme sted med timers mellemrum, og følge udviklingen flere steder i præparatet på én gang.

Kølekæden

Mikroskopet har andre finesser. Man kan for eksempel skylle væsker ind over præparatet i en præcis og kontinuerlig strøm. Og der er mulighed for temperaturkontrol:

"Rent praktisk kan vi bruge det til at undersøge hvad der sker, når en forbruger køber en kølevare og holder varen ved stuetemperatur i 2 timer, inden de kommer hjem og lægger den i deres eget køleskab," forklarer Henrik Siegumfeldt og fortsætter:

"Det er det klassiske problem med brud på kølekæden. Vi kan undersøge, om det er alle bakteriecellerne i fødevaren, der begynder at vokse, eller om det kun er nogle få, som sætter det hele i gang. Og hvis det er tilfældet, hvad er det så, der adskiller disse celler fra de andre?"

Spænding i søvnen

"Det ultimative mål, også for forbrugerne, er at forstå hvad der sætter en bakteriecelle i gang med at vokse," siger Henrik Siegumfeldt.

"Grundlæggende vil vi gerne forhindre patogene (sygdomsfremkaldende) mikroorganismer i at vokse, og få de gode til at vokse så hurtigt som muligt. Og jo mere vi ved om, hvad der styrer væksten, desto bedre kan vi bremse væksten af de patogene organismer, og fremme væksten af de gode mikroorganismer" fortæller han.

Når man skal beskrive mikroorganismers vækst, gør man det almindeligvis med en nølefase, en eksponentiel vækstfase, en stationær fase og en dødsfase.

Størstedelen af den mikrobiologiske forskning har været koncentreret om den eksponentielle vækstfase, men Henrik Siegumfeldt synes, at denne fase er uinteressant, fordi det er en forsvindende lille del af mikroorganismernes liv.

En E. coli bakterie vil normalt kun vokse eksponentielt i 4-6 timer, inden den har opbrugt næringssubstratet.

"Den stationære fase er ofte meget interessant, for det er denne fase, som bakterierne sandsynligvis ligger i når de er ude i levnedsmidlerne," forklarer han og fortsætter:

"De patogene bakterier vil meget ofte også ligge i en eller anden form for hvilestadie. Vi er interesserede i, hvad der sker, når man tager celler fra den stationære fase og putter dem i friskt medie."

"Så er det man får denne nølefase, hvor cellerne skal indstille sig på, at de kan begynde at vokse. Hvis de er gået i dvale, kan det være, at der er nogle proteiner, som beskytter mod at væksten går igang af sig selv. De skal fjernes, før cellen kan begynde at vokse," siger Siegumfeldt.

Early events

"Cellen skal dele sit DNA, så cellen kan deles i to. Den skal begynde at lave cellevægsmateriale. Dette er nølefasen. Selvom cellerne ikke deler sig i nølefasen, foregår der altså ting inde i cellerne. Og det er det, man kalder early events. For det er events, som foregår inden man kan se de vokser" fortæller han.

Det er vigtigt for en producent af levnedsmidler at forstå, hvad der sker i nølefasen, for hvis det drejer sig om starterkulturer til mejeriprodukter vil man primært have gjort fasen så kort som muligt, og hvis det drejer sig om patogene bakterier, eller fordærv-bakterier, vil man have gjort nølefasen uendelig lang.

pHi som fluorescens

Når Henrik Siegumfeldt studerer enkeltceller, er det næsten altid med det mål at finde et svar til spørgsmålet om "hvordan cellerne har det".

Men som han selv udtrykker det, er han i samme situation som en dyrlæge i forhold til en læge – dyrlægen kan ikke spørge sin patient om hvordan den har det.Henrik Siegumfeldt må altså selv finde svarene på sine spørgsmål.Surhedsgraden inde i cellerne, pHi, er ofte et godt mål for hvordan celler har det. De fleste bakterie- eller gærceller vokser bedst ved neutral pH (6-8), men de kan ofte godt tåle, at der bliver lidt surt omkring dem.

Der er dog kun få af dem, der bryder sig om, at der er surt inde i cellen.Det skyldes, at de fleste enzymer virker ved neutral pH, og DNA har det også godt.Ved at måle pHi får man altså et mål for, hvordan cellen har det.

Til det brug har Henrik Siegumfeldt stor nytte af de pH-følsomme fluorescerende farvestoffer, som fluorescerer mere eller mindre når pH-værdien ændres. Faktisk er de fluorescerende stoffer så følsomme, at man kan bestemme pHi på en enkelt celle med en nøjagtighed på mindre end 0,2 enhed:

"pH er jo logaritmisk. Det vil sige, at der er ti gange så mange H+-ioner ved pH 5 som ved pH 6 og så videre," fortæller Henrik Siegumfeldt.

"Cellernes volumen er meget lille, og hvis man regner på det, vil der ved pH 5 være 3000 hydrogenatomer inde i en enkelt celle med en diameter på en mikrometer, 300 hydrogenatomer ved pH 6, 30 ved pH 7, og 3 ved pH 8," forklarer han.

"Når vi siger, at vi kan måle pH med så stor nøjagtighed, betyder det faktisk, at vi kan måle om der er 3 hydrogenatomer (pH 8) eller 5 hydrogenatomer (pH 7,8). Det viser, at fluorescens er en ufattelig præcis teknik" forklarer Henrik Siegumfeldt stolt.

Gen fra en vandmand

Henrik Siegumfeldt har lige afsluttet et spændende samarbejde med en ungarsk forsker. Projektet gik ud på at undersøge et bestemt gen, som er gensplejset fra en vandmand over i bakterier. Genet hedder green fluorescent protein, gfp, og koder, som navnet siger, for et fluorescerende protein.

Nogle amerikanske forskere har fundet ud af, at man kan ændre en ganske lille struktur i gfp-genet, så det bliver pH-følsomt. Man kan dermed måle pH i bakterierne uden at tilsætte de fluorescerende farvestoffer.

Gensplejsede bakterier har ingen kommerciel interesse, men det er ofte fordelagtigt for forskerne. De har netop brugt det til at måle pHi i kød, som er pakket i modificeret atmosfære (som man køber kød i Netto). Så kan de måle pHi i cellerne uden at åbne emballagen.

Anerkendt forskning

Al dansk forskning i levnedsmidler bliver styret af Levnedsmiddelcentret (LMC), som er en paraplyorganisation over de institutter ved Det Biovidenskabelige Fakultet og Danmarks Tekniske Universitet som beskæftiger sig med levnedsmidler.

Hovedaktørerne i dette samarbejde er Mejeri- og Levnedsmiddelinstituttet og Forskningsinstitut for Human Ernæring ved Det Biovidenskabelige Fakultet samt BioCentrum ved DTU.

Levnedsmiddelcentret er, som det første i Europa indenfor fødevareforskning, blevet udnævnt til Major Research Infrastructure – et navn der dækker over, at forskningen ved centret er så fremragende, at EU gerne vil støtte andre europæiske forskere i at komme til Danmark for at lære og benytte det danske udstyr.

Et af indsatsområderne er netop forskningen i enkeltceller med det avancerede mikroskop.Til toppen